 |
Hızlı DNA Kitaplığı Hazırlama Kiti V2 K001S-A, K001S-B
Ürün ayrıntıları:
| Menşe yeri: | Çin |
| Marka adı: | GDSBio |
| Sertifika: | ISO9001, ISO13485 |
| Model numarası: | K001S-A, K001S-B |
Ödeme & teslimat koşulları:
| Min sipariş miktarı: | 1 takım |
|---|---|
| Ambalaj bilgileri: | küçük paket veya toplu dağıtım veya OEM |
| Teslim süresi: | 8 iş günü |
| Ödeme koşulları: | L/C, D/A, D/P, T/T, Western Union, MoneyGram |
| Yetenek temini: | Günde 1000 Kit |
|
Detay Bilgi |
|||
| Stoklamak: | Evet | Kedi. HAYIR.: | K001S-A, K001S-B |
|---|---|---|---|
| Şartname: | K001S-A/24 rxns; K001S-B/96 rxns; numune torbası/ 6 rxns | Dış görünüş: | Eksiksiz, hasarsız |
| Kitaplık Türü: | DNA | Sıralama Platformu: | illumina |
| Logo Baskısı: | Logo Baskılı | Taşıma Paketi: | Paketleme |
| Üretim kapasitesi: | Günde 1000 Kit | Depolama koşulları: | -20°C, 12 aylık geçerlilik süresi ile. |
| Vurgulamak: | GDSBio Tek Kullanımlık Virüs Örnekleme Tüpü,Sınıf I Tek Kullanımlık Virüs Örnekleme Tüpü,%100 Naylon virüs örnekleme tüpü |
||
Ürün Açıklaması
Hızlı DNA Kütüphanesi Hazırlama KitiV2
[Ürün adı]
Hızlı DNA Kütüphanesi Hazırlama Kiti V2
[Kedi.No./Spec.]
K001S-A/24 rxns;K001S-B/96 rxns;numune torbası/ 6 rxns
[Ürün Açıklaması]
Illumina'nın yüksek verimli dizileme platformunu hedefleyen bu kit, tek bir tüpte kullanışlı ve evrensel bir DNA kitaplığı oluşturma şeması sağlar.Son onarımı ve A-Tailing'i tek bir adımda birleştirerek kitaplık oluşturma süresini büyük ölçüde kısaltır ve sıkıcı adımların neden olduğu hatayı azaltır.Parçalanmış çift sarmallı DNA'nın son hazırlığı, adaptör ligasyonu, amplifikasyonu ve saflaştırılması yaklaşık 2 saat içinde gerçekleştirilebilir.Eksiksiz kitaplık ölçümü, kitaplık uygun bir konsantrasyona seyreltildikten sonra dsDNA floresan boya yöntemi (örn. Thermo Qubit Flex Fluorometer) veya mutlak niceleme PCR ile gerçekleştirilebilir.
[Örnek tip]
| Başvuru | Örnek tip | Önerilen Miktar |
| Tüm genom dizilimi | Yüksek kaliteli karmaşık genomlar | 50ng-1μg |
| Tüm ekzomun hedef yakalama dizilimi | Yüksek kaliteli karmaşık genomlar | 10ng-1μg |
| Tüm genomun hedef yakalama dizilimi | FFPE DNA'sı | ≥50ng |
| Tüm genomun hedef yakalama dizilimi | cfDNA/ctDNA | ≥100pg |
| Tüm genom dizilimi | Mikrobiyal genom | 1ng-1μg |
| Tüm genom dizileme (PCR içermez) | Yüksek kaliteli DNA |
≥50ng (boyut seçimi yok) ≥200ng (boyut seçimi) |
| Çip-Seq | Çip DNA'sı | ≥100pg |
| hedeflenen sıralama | amplikon | ≥100pg |
[Saklama Durumu ve Raf Ömrü]
Tüm reaktifler -20°C'de saklanmalıdır.Ligasyon Tamponu düşük sıcaklıklarda kristallerin çökelmesi normaldir, kullanımdan önce oda sıcaklığına dengelenmelidir.Ürün 12 ay geçerlidir.
[Bileşenler]
| Bileşen | 24 rxn | 96 rxns |
| End Repair & A-Tailing Enzim Karışımı | 120 ul | 2×240 ul |
| Onarımı Sonlandır ve A-Takıntı Tamponu | 240 ul | 2×480 ul |
| Hızlı DNA Ligaz | 120 ul | 2×240 ul |
| Hızlı Ligasyon Tamponu | 600 ul | 4×600 ul |
| 2× HIFI Kitaplığı PCR Ana Karışımı | 600 ul | 4×600 ul |
| Astar Karışımı* | 120 ul | 480 ul |
* Birden fazla örnek olması durumunda #K002 ve #K003 adaptör astar karışımı önerilir.Bu kit, indeksli bir dizi primer sağlar.
Not:önerilen seçim boncukları: #NC1011 GDSPure DNA Selection Magbeads veya AMPure XP boncukları.
[Notlar]
1. İki tür Evrensel Adaptör primer seti sunuyoruz (GDS Adaptörü, #K002 ve #K003, ayrıca satın alınır), ancak müşteriler ayrıca diğer üreticiler arasından seçim yapabilir veya Illumina sıralama platformu için kendi Adaptörlerini sentezleyebilir.Çok fazla Bağdaştırıcı, Bağdaştırıcı dimerinin oluşmasına neden olur ve yetersiz Bağdaştırıcı, düşük kitaplık çıkışına yol açar.Bu nedenle, uygun Adaptör konsantrasyonu kitaplığın konsantrasyonunu ve kalitesini belirler.Farklı miktarlarda DNA girişi için önerilen adaptör konsantrasyonları aşağıdaki tabloda gösterilmektedir:
Tablo 1 Adaptörün Önerilen Kullanım Konsantrasyonları
| DNA Girişi | Önerilen Kons.Adaptör için | Bağdaştırıcı: Mol Oranını Girin* | GDS Adaptör Seyreltme Dereceleri |
| 1μg | 10uM | 10:1 | Seyreltme yok |
| 500ng | 10uM | 20:1 | Seyreltme yok |
| 250ng | 10uM | 40:1 | Seyreltme yok |
| 100ng | 7.5uM | 100:1 | 3:4 |
| 50ng | 5uM | 200:1 | 1:2 |
| 25ng | 2.5uM | 200:1 | 1:4 |
| 1ng | 1uM | 200:1 | 1:10 |
* Bağdaştırıcı:Ekleme mol oranı, diğer kaynaklardan gelen Bağdaştırıcı molar sayısının Giriş DNA molar sayısına oranını ifade eder; bu, aşağıdaki formüle başvurarak kabaca hesaplanabilir:
Giriş DNA numarası (pmol)≈Giriş DNA kütlesi (ng)/[0,66×Giriş DNA ortalama uzunluğu (bp)]
*Bağdaştırıcının kalitesi ve konsantrasyonu, özellikle düşük girişli kitaplıklar için kitaplığın çıktısını büyük ölçüde etkiler.Yüksek kaliteli bir kaynaktan Adaptör seçilmeli ve ligasyondan önce 0,1×TE ile uygun bir konsantrasyona seyreltilmelidir.Anında kullanım için, her numune ilavesinin sabit bir 5 µl olduğundan emin olun, numune ekleme hatalarından kaçının ve tekrarlanan donma-çözülmeden kaçınmaya çalışın.
2. 2× HIFI Library PCR Master Mix'te kullanılan enzim, 5 '-3' polimeraz ve 3 '-5' ekzonükleaz aktivitesine sahip, ancak 5 '-3' ekzonükleaz aktivitesine sahip olmayan bir B familyası DNA polimerazdır.Yüksek sadakat ve homojenliğe ve güçlü sürdürülebilir sentez yeteneğine sahiptir.Amplifikasyon döngülerinin sayısının sıkı kontrolü, kitaplık çıktısı için özellikle önemlidir.Aşağıdaki tablo, farklı DNA giriş miktarlarına karşılık gelen önerilen amplifikasyon döngüsü sayısını göstermektedir:
Tablo 2 Farklı Numune Girişlerine Karşılık Gelen Önerilen Amplifikasyon Döngüsü Sayısı
| Giriş DNA'sı | Tavsiye Edilen Amplifikasyon Döngüsü Sayısı | |
| 100ng Kitaplık | 1μg Kütüphane | |
| 1μg | 0 | 2-5 |
| 500ng | 0 | 2-5 |
| 250ng | 1-3 | 5-7 |
| 100ng | 2-4 | 6-8 |
| 50ng | 4-6 | 8-10 |
| 25ng | 5-7 | 9-12 |
| 10ng | 7-9 | 11-13 |
| 5ng | 9-11 | 13-14 |
| 2.5ng | 10-12 | 14-16 |
| 1ng | 11-13 | 15-17 |
Not: 1. Yukarıdaki tablo, yalnızca referans amaçlı olan 150bp standart DNA kullanılarak yapılan test sonuçlarını göstermektedir.
2. Eksik konektörler kullanılıyorsa, eksiksiz bir kitaplık elde etmek için minimum döngü sayısı (1-3) yükseltilmelidir.
3. Giriş DNA'sının kalitesi düşükse veya boyut seçimi kitaplık yapımı sırasında yapılıyorsa, amplifikasyon döngülerinin sayısı uygun şekilde artırılmalıdır.
[Standart Kitaplık Oluşturma Süreci]
Onarımı Sonlandır
Not: Parçalanmış DNA bu adımdan önce 45 μl'yi aşarsa veya tampon, son onarım tamponuyla uyumsuzsa, önce bir manyetik boncuk saflaştırması gerçekleştirilmelidir.
1. Aşağıdaki reaksiyonu 200 µl'lik bir PCR tüpünde hazırlayın:
| reaktifler | Hacim |
| Parçalanmış DNA | Değişken |
| End Repair & A-Tailing Enzim Karışımı | 5 ul |
| Onarımı Sonlandır ve A-Takıntı Tamponu | 10 ul |
| gg2Ö | 65 ul'ye kadar |
2. Yavaşça vorteksleyin ve iyice karıştırmak için kısaca döndürün, kısa bir süre santrifüjleyin ve tüm sıvıyı tüpün dibine toplayın.
3. Bir termal döngüleyicide aşağıdaki reaksiyonu gerçekleştirin:
| Sıcaklık | Zaman |
| 20°C | 15 dakika |
| 65°C | 15 dakika |
| 4°C | ∞ |
Adaptör Ligasyon
1. Son hazırlıktan sonra mümkün olan en kısa sürede ligasyon reaksiyonuna devam edin.
2. Adaptörü Tablo 1'e göre seyreltin.
3. Aşağıdaki reaksiyon sistemini hazırlayın:
| reaktifler | Hacim |
| Son onarım ve A-Tailing ürünleri | 65 ul |
| Hızlı Ligasyon Tamponu | 25 ul |
| Hızlı DNA Ligaz | 5 ul |
| Adaptör X | 5 ul |
| Toplam | 100 ul |
4. Yavaşça vorteksleyin ve iyice karıştırmak için kısaca döndürün, kısaca santrifüjleyin ve tüm sıvıyı tüpün dibine toplayın.
5. Bir termal döngüleyicide aşağıdaki reaksiyonu gerçekleştirin:
| Sıcaklık | Zaman |
| 20°C | 15 dakika |
| 4°C | ∞ |
Tavsiye edilenSiçin çözümPCR Temizleme/Beden Seçimi(belirli manyetik boncuk hacmi, gerçek numuneye göre ayarlanmalıdır.boyut)
1. Uygun bir santrifüj tüpüne 100 µl ligasyon ürünü hazırlayın.
2. Numuneye 100 µl yeniden süspanse edilmiş DNA seçim manyetik boncukları ekleyin.Bir pipetle 10 kez hafifçe üfleyin (veya 30 saniye vorteksleyin).Örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
3. Boncukları süpernatandan ayırmak için tüpü uygun bir manyetik rafa yerleştirin.Çözelti berrak olduğunda, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve bir pipetle atın (boncukları atmayın).
4. Manyetik raftayken tüpe 200 µl %80 taze hazırlanmış etanol ekleyin.Oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin ve ardından süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın (boncukları rahatsız etmeyin).
5. Toplam iki yıkama için Adım 4'ü bir kez tekrarlayın.
Not: İkinci yıkamadan sonra tüm görünür sıvıyı çıkardığınızdan emin olun.
6. Tüp kapağı açıkken manyetik raftayken, manyetik boncukların yüzeyinde belirgin bir parlaklık kalmayana kadar boncukları havayla kurutun.
Not: Boncukları fazla kurutmayın, bu DNA'nın daha düşük geri kazanımına neden olabilir.Boncuklar çatlamaya başladığında çok kurudurlar.
7. Tüpü manyetik raftan çıkarın.Tüpe 22 ul elüsyon tamponu (10mM Tris-HCl, pH8.0-8.5) ekleyin.En az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak veya bir vorteks karıştırıcıda 30 saniye boyunca iyice karıştırın.Oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edin.
8. Tüpü manyetik rafa yerleştirin.5 dakika sonra (veya solüsyon berraklaştığında), 20 µl süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.Seçim tamamlanır ve seçilen DNA sonraki deneyler için kullanılabilir veya -20°C'de uzun süre saklanabilir.
Kütüphane Amplifikasyonu
1. Aşağıdaki reaksiyonu 200 µl'lik bir PCR tüpünde hazırlayın:
| reaktifler | Hacim |
| Temizleme veya boyut seçiminden sonra ligasyon ürünleri | 20 ul |
| 2× HIFI Kitaplığı PCR Ana Karışımı | 25 ul |
| Astar karışımı | 5 ul |
| Toplam | 50 ul |
2. Yavaşça vorteksleyin ve iyice karıştırmak için kısaca döndürün, kısa bir süre santrifüjleyin ve tüm sıvıyı tüpün dibine toplayın.
3. Bir termal döngüleyicide aşağıdaki reaksiyonu gerçekleştirin:
| Sıcaklık | Zaman | Döngü Numarası |
| 95°C | 3 dakika | 1 |
| 98°C | 20 saniye |
Tablo 2'ye göre uygun döngü sayısını seçin |
| 60°C | 15 saniye | |
| 72°C | 30 saniye | |
| 72°C | 5 dakika | 1 |
| 4°C | ∞ | - |
Tavsiye edilenSiçin çözümPCR Temizleme/Beden Seçimi(belirli manyetik boncuk hacmi, gerçek numuneye göre ayarlanmalıdır.boyut)
1. Uygun bir santrifüj tüpüne 50 µl ligasyon ürünü hazırlayın.
2. Numuneye 45 µl yeniden süspanse edilmiş DNA seçim manyetik boncukları ekleyin.Bir pipetle 10 kez hafifçe üfleyin (veya 30 saniye vorteksleyin).Örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
3. Boncukları süpernatandan ayırmak için tüpü uygun bir manyetik rafa yerleştirin.Çözelti berrak olduğunda, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve bir pipetle atın (boncukları atmayın).
4. Manyetik raftayken tüpe 200 µl %80 taze hazırlanmış etanol ekleyin.Oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin ve ardından süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın (boncukları rahatsız etmeyin).
5. Toplam iki yıkama için Adım 4'ü bir kez tekrarlayın.
Not: İkinci yıkamadan sonra tüm görünür sıvıyı çıkardığınızdan emin olun.
6. Tüp kapağı açıkken manyetik raftayken, manyetik boncukların yüzeyinde belirgin bir parlaklık kalmayana kadar boncukları havayla kurutun.
Not: Boncukları fazla kurutmayın, bu DNA'nın daha düşük geri kazanımına neden olabilir.Boncuklar çatlamaya başladığında çok kurudurlar.
7. Tüpü manyetik raftan çıkarın.Tüpe 22 ul elüsyon tamponu (10mM Tris-HCl, pH8.0-8.5) ekleyin.En az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak veya bir vorteks karıştırıcıda 30 saniye boyunca iyice karıştırın.Oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edin.
8. Tüpü manyetik rafa yerleştirin.5 dakika sonra (veya solüsyon berraklaştığında), 20 µl süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.Seçim tamamlanır ve seçilen DNA 2-8°C'de 1-2 hafta veya -20°C'de uzun süre saklanabilir.
[Ek]Çift Taraflı Seçim için Önerilen Şema
Çift turlu seçim gerekirse, beklenen kitaplık boyutuna göre uygun manyetik boncuk hacmini seçmek için aşağıdaki şemayı sağlıyoruz.Boyut seçimi, son onarımdan önce veya amplifikasyondan sonra yapılabilir.İki veya daha fazla çift turlu seçim, kitaplık verimini büyük ölçüde azaltacaktır.
Aşağıdaki tablodaki kitaplık hacmini 100 μl'ye kadar doldurun.Beklenen kitaplık boyutuna göre iki turda manyetik boncukların hacmini seçin.Ve seçim işlemini aşağıdaki talimatlara göre gerçekleştirin.
Tablo 3 Çift Yuvarlak Seçim için Tavsiye Edilen Manyetik Boncuk Miktarı
| Beklenen Kitaplık Boyutu | 150bp | 200bp | 250bp | 300bp | 400bp | 500bp | 600bp | 700bp | |
| Boncuk Hacmi (ul) | 1. tur | 100 | 90 | 80 | 70 | 60 | 55 | 50 | 45 |
| 2. devre | 30 | 20 | 20 | 20 | 20 | 15 | 15 | 15 | |
1. Kütüphane hacmini 200 µl'lik bir PCR tüpünde 100 µl'ye doldurun ve A olarak etiketleyin. A tüpüne Tablo 3'e (1. Tur) göre belirli bir hacimde Manyetik boncuk ekleyin. Bir pipetle 30 s hafifçe üfleyin.Örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
2. Boncukları süpernatandan ayırmak için tüp A'yı uygun bir manyetik rafa yerleştirin.Çözelti berraklaştığında, süpernatantı yeni bir tüpe dikkatlice alın ve B olarak etiketleyin. Boncukları atın.
3. B tüpüne Tablo 3'e (2. Tur) göre belirli bir hacimde Manyetik boncuk ekleyin. 30 saniye boyunca bir pipetle hafifçe üfleyin.Örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.Tüp B'yi manyetik rafa yerleştirin.Çözelti berrak olduğunda, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
4. Manyetik raftayken tüp B'ye 200 µl %80 taze hazırlanmış etanol ekleyin.Oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin ve ardından süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın (boncukları rahatsız etmeyin).
5. Toplam iki yıkama için Adım 6'yı bir kez tekrarlayın.
Not: İkinci yıkamadan sonra tüm görünür sıvıyı çıkardığınızdan emin olun.
6. B tüpü kapağı açıkken manyetik raftayken, manyetik boncukların yüzeyinde belirgin bir parlaklık kalmayana kadar boncukları havayla kurutun.
Not: Boncukları fazla kurutmayın, bu DNA'nın daha düşük geri kazanımına neden olabilir.Boncuklar çatlamaya başladığında çok kurudurlar.
7. Tüp B'yi manyetik raftan çıkarın.Tüpe 22 ul elüsyon tamponu ekleyin.En az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak veya bir vorteks karıştırıcıda 30 saniye boyunca iyice karıştırın.Oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edin.
Not: Hedeflenen yakalama gerçekleştirilmeyecekse elüsyon için elüsyon tamponu (10mM Tris-HCl, ph 8.0-8.5) ekleyin.Aksi takdirde elüsyon için sterilize edilmiş ultra saf su kullanılmalıdır.
- Tüp B'yi manyetik rafa yerleştirin.20 ul süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
Yalnızca Araştırma Kullanımı İçin
