 |
First Strand CDNA Sentez Kiti R1011/R1012 Ters Transkriptaz PCR Reaktifleri
Ürün ayrıntıları:
| Menşe yeri: | Çin |
| Marka adı: | GDSBio |
| Sertifika: | / |
| Model numarası: | R1011/R1012 |
Ödeme & teslimat koşulları:
| Min sipariş miktarı: | 1 kutu |
|---|---|
| Ambalaj bilgileri: | küçük paket veya toplu dağıtım veya OEM |
| Teslim süresi: | 8 iş günü |
| Ödeme koşulları: | L/C, D/A, D/P, T/T, Western Union, MoneyGram |
| Yetenek temini: | Günde 100 kutu/kutu |
|
Detay Bilgi |
|||
| Kedi. HAYIR.: | R1011/R1012 | Konsantrasyon: | R1011 (20 rxns),R1012 (100 rxns) |
|---|---|---|---|
| Dış görünüş: | renksiz | Grup: | Ters Transkriptaz PCR Reaktifleri |
| Aktivite: | Geçmek | Amplifikasyon yeteneği: | / |
| Logo Baskısı: | Logo Baskılı | Taşıma Paketi: | Paketleme |
| Üretim kapasitesi: | Günde 100 kutu/kutu | Depolama koşulları: | -20°C'de saklayın |
| Vurgulamak: | 20 rxns Ters Transkriptaz PCR Reaktifleri,100 rxns Ters Transkriptaz PCR Reaktifleri,20 rxns birinci sarmal cdna sentez kiti |
||
Ürün Açıklaması
RT - PCR Kiti
Sadece araştırma amaçlı
Kat No. R1011, 20 rxns
Kat No. R1012, 100 rxns
Kitin bileşenleri
| Bileşen | R1011 (20 rxns) | R1012 (100 rxns) |
| M-MLV (200U/ul) | 20 ul | 100 ul |
| RNazin (40U/μl) | 12 ul | 60 ul |
| Oligo(dT)15(50uM) | 20 ul | 100 ul |
| Rastgele heksamer primer (50μM) | 20 ul | 100 ul |
| 5× Birinci iplik Tamponu | 80 ul | 400 ul |
| RNaz içermeyen ddH2Ö | 1 ml | 1 ml × 5 |
| dNTP'ler(her biri 10mM) | 50 ul | 250 ul |
Depolamak
Kitin tüm bileşenleri -20°C'de saklanmalıdır.Daha uzun süre saklamak için kontrol RNA'sını -70°C'de tutun.
Daçıklama
RT-PCR Kiti, saflaştırılmış poli(A)+ veya toplam RNA'dan birinci sarmal cDNA'yı sentezlemek için optimize edilmiştir.RT-PCR için RT-PCR Kiti, uygun bir formatta artan cDNA verimleri, yüksek hassasiyet ve tam uzunlukta transkriptler sunar.Başarılı birinci iplikçik cDNA sentezi için ihtiyaç duyduğunuz tüm bileşenleri elde ederek zamandan tasarruf eder ve her deneyde başarınızı garanti altına alırsınız.Reverse Transcriptase kiti, RNase H aktivitesini azaltmak ve termal kararlılığı artırmak için tasarlanmış bir M-MLV RT versiyonudur.Enzim, cDNA'yı 42-55°C sıcaklık aralığında sentezlemek için kullanılır ve diğer ters transkriptazlardan daha yüksek özgüllük, daha yüksek cDNA verimi ve daha fazla tam uzunlukta ürün sağlar.
Uygulamalar
RT-PCR için ilk sarmal cDNA sentezi
cDNA kitaplıklarının oluşturulması
Tek adımlı RT-PCR
Primer uzatma
BENönemli notlar
Ribonükleaz kontaminasyonundan kaçınma
RNA saflığı ve bütünlüğü, tam uzunluktaki cDNA'nın sentezi için esastır.RNA, herhangi bir laboratuvar ortamında bulunan oldukça kararlı bir kirletici olan RNase A tarafından parçalanabilir.Kitin tüm bileşenleri, RNaz içermediğinden emin olmak için titizlikle test edilmiştir.Hem laboratuvar ortamının hem de reaktiflerin kontaminasyonunu önlemek için hazırlanan tüm solüsyonlarda RNaz bulunmamalıdır.RNase kontaminasyonunu önlemek için genel öneriler:
- cDNA sentezinde kullanılacak tüm tüpleri ve pipet uçlarını DEPC ile işleme tabi tutun veya sertifikalı nükleaz içermeyen laboratuvar gereçleri kullanın.
- Cilt yaygın bir RNaz kaynağı olduğundan, RNA ve tüm reaktiflerle çalışırken eldiven giyin.Eldivenleri sık sık değiştirin.
- Yüksek kaliteli su (örn. DEPC ile işlenmiş Su) dahil olmak üzere RNaz içermeyen reaktifler kullanın.
- RNA'yı RNazların aktivitesinden korumak için Dongsheng RNazin (#R2011) gibi bir RNaz inhibitörü kullanın.
- Kullanılmadığında tüm kit bileşenlerini sıkıca kapalı tutun.Ters transkripsiyon reaksiyonu sırasında tüm tüpleri sıkıca kapalı tutun.
Şablon RNA'sı
Kit ile kullanım için standart yöntemlerle izole edilen total hücresel RNA uygundur.Saflaştırılmış RNA, cDNA sentez reaksiyonunu inhibe etmekten kaçınmak için tuzlar, metal iyonları, etanol ve fenol içermemelidir.İz kirleticiler, RNA'nın etanol çökeltmesi ve ardından peletin soğuk %75 etanol ile iki kez yıkanmasıyla giderilebilir.RT-PCR uygulamaları için şablon RNA'nın DNA kontaminasyonu içermemesi gerekir.cDNA sentezinden önce, eser miktarda DNA'yı çıkarmak için RNA, DNaz I ile işlenebilir.DNase I kullanıcı tarafından alınmalıdır.Ters transkriptaz enzimi dışında her zaman RT-PCR için tüm bileşenleri içeren bir kontrol (RT-eksi) reaksiyonu gerçekleştirin.
RNaz H Sindirimi
PCR adımının hassasiyeti (özellikle uzun şablonlar için), birinci sarmal sentezinden sonra RNase H ile sindirilerek cDNA:RNA hibrit molekülünden RNA şablonu çıkarılarak artırılabilir.Birinci sarmal sentezi sırasında RNaz H'nin varlığı şablon mRNA'yı bozacak, bu da tam uzunluklu cDNA sentezinin azalmasına ve birinci sarmal cDNA'nın veriminin düşmesine neden olacaktır.
Astarlar
Birinci sarmal cDNA'nın sentezi, oligo(dT)15 primeri, rastgele primerler veya gene özgü primerler ile hazırlanabilir.
Oligo(dT)15, ökaryotik mRNA'nın 3'-ucunda bulunan poli(A) kuyruğundan cDNA sentezini başlatır.Rastgele Primerler, toplam RNA popülasyonundan (rRNA ve mRNA) cDNA sentezini başlatır.Bu nedenle, birinci sarmal sentezi için rastgele primerlerin kullanılması, oligo(dT)15 primeriyle karşılaştırıldığında üretilen cDNA'nın daha büyük bir karmaşıklığına yol açar.Sonuç olarak, sonraki PCR reaksiyonlarının hassasiyeti ve özgüllüğü azalabilir.Bununla birlikte, poli(A) kuyruğu olmayan mRNA'lar kullanılarak cDNA sentezi veya poli(A) ile zenginleştirilmiş RNA numuneleri kullanılarak cDNA sentezi gibi rastgele primerler kullanmanın faydalı olduğu birkaç uygulama vardır.
Gene özgü primerler, toplam RNA veya mRNA havuzundan belirli cDNA'yı sentezlemek için kullanılır ve kullanıcı tarafından elde edilmelidir.
Birinci- Strand cDNA sentezi prosedürü
Birinci sarmal cDNA reaksiyonu, bireysel bir reaksiyon olarak veya farklı RNA şablonları ile bir dizi paralel reaksiyon olarak gerçekleştirilebilir.Bu nedenle reaksiyon karışımı, reaktiflerin ayrı ayrı birleştirilmesiyle hazırlanabilir veya şablon RNA hariç tüm bileşenleri içeren bir ana karışım hazırlanabilir.RNA şablonunun yapısına bağlı olarak, RNA denatürasyonu ve primer tavlama için ayrı adımlar RT-PCR sonuçlarını iyileştirebilir.
Protokol
BEN.Birinci zincir cDNA sentezi
1. Aşağıdaki reaktifleri belirtilen sırayla buz üzerinde steril, nükleaz içermeyen bir tüpe ekleyin:
| Şablon RNA'sı |
poli(A) mRNA veya spesifik RNA |
1-5 mikrogram |
| Astar |
oligo (dT)15astar veya Rastgele heksamer astar |
1 ul 1 ul |
| DEPC ile arıtılmış su | 12.4 ul'ye | |
| Toplam ses | 12.4 ul | |
2. Yavaşça karıştırın, kısa süre santrifüjleyin ve 70°C'de 5 dakika inkübe edin.Buz üzerinde soğutun, aşağı doğru döndürün ve şişeyi tekrar buza yerleştirin.
3. Aşağıdaki cDNA Sentez Karışımını hazırlayın, aşağıdaki bileşenleri belirtilen sırayla ekleyin:
| 5× birinci iplik tamponu | 4 ul |
| dNTP'ler(her biri 10 mM) | 1 ul |
| RNazin | 0.6 ul |
| M-MLV | 1 ul |
4. Yavaşça karıştırın ve kısa süre santrifüjleyin.
5. Oligo(dT) için15, 42°C'de 60 dakika inkübe edin.Rastgele heksamer prime edilmiş sentez için, 37°C'de 60 dakika inkübe edin.
6. Reaksiyonu 70°C'de 5 dakika ısıtarak sonlandırın.
Ters transkripsiyon reaksiyonu ürünü, ikinci sarmal cDNA sentezi reaksiyonlarında hemen kullanılabilir veya -20°C'de bir haftadan daha kısa süre saklanabilir.Daha uzun süreli depolama için -70°C tavsiye edilir.
II.Birinci Sarmal cDNA'nın PCR Amplifikasyonu
Birinci sarmal cDNA sentezinin ürünü doğrudan PCR veya qPCR'de kullanılabilir.Birinci sarmal cDNA sentezi reaksiyon karışımının hacmi, toplam PCR reaksiyon hacminin 1/10'undan fazlasını içermemelidir.Normal olarak, birinci zincir cDNA sentezi reaksiyon karışımının 2 ul'si, sonraki PCR için 50 ul toplam hacimde şablon olarak kullanılır.
Dongsheng Biotech, PCR başarısına ulaşmanıza yardımcı olacak farklı ürün serileri sunar.Enzimler için Taq Polimeraz, HS Taq DNA Polimeraz, FS Taq DNA Polimeraz, Pfu DNA Polimeraz ve Fusion Pfu DNA Polimeraz ürünümüz yüksek doğrulukta, verimli, hassas PCR performansı sağlar.Ayrıca uzun PCR performansı için Long Taq DNA Polymeraz'a sahibiz.
