GDSBio NGS Kitaplığı İnşaatı Hızlı DNA Kitaplığı Artı MGI için Hazırlık Kiti

Ürün Açıklaması

Hızlı DNA KütüphanesiArtıHazırlık KitiMGI için

[Ürün adı]

MGI için Fast DNA Library Plus Hazırlık Kiti

[Kedi.No./Spec.]

KM004-A/24 rxns;KM004-B/96 rxns;numune torbası/ 6 rxns

[Ürün Açıklaması]

MGI yüksek verimli dizileme platformunu hedefleyen bu kit, tek bir tüpte kullanışlı ve evrensel bir DNA kitaplığı oluşturma şeması sağlar.Parçalanma, son onarım ve A-Tailing'i tek bir adımda birleştirerek kitaplık oluşturma süresini büyük ölçüde kısaltır ve sıkıcı adımların neden olduğu hatayı azaltır.Fragmentasyon ve son hazırlığın ardından ürün, ek saflaştırma olmaksızın doğrudan adaptörle bağlanabilir ve sonraki prosedür, MGI için #KM001 Hızlı DNA Kütüphanesi Hazırlama Kiti ile aynıdır.Eksiksiz kitaplık ölçümü, kitaplık uygun bir konsantrasyona seyreltildikten sonra dsDNA floresan boya yöntemi (örn. Thermo Qubit Flex Fluorometer) veya mutlak niceleme PCR ile gerçekleştirilebilir.

[Örnek tip]

Tablo 1 Ortak DNA için Önerilen Girdiler

[Saklama Durumu ve Raf Ömrü]

Tüm reaktifler -20°C'de saklanmalıdır.Ligasyon Tamponu düşük sıcaklıklarda kristallerin çökelmesi normaldir, kullanımdan önce oda sıcaklığına dengelenmelidir.Ürün 12 ay geçerlidir.

[Bileşenler]

*FEP Tamponu parçalanma ve son hazırlama reaksiyon tamponudur.FEP Enzim Karışımı, parçalanma ve son hazırlama ile ilgili bir enzim karışımıdır.

* Birden fazla örnek olması durumunda #KM002 ve #KM003 adaptör astar karışımı önerilir.Bu kit bir dizi primer sağlar, primer dizisi aşağıdaki gibidir:

5'-TGTGAGCCAAGGAGTTG-3'

5'-GAACGACATGGCTACGA-3'

Not:önerilen seçim boncukları: #NC1011 GDSPure DNA Selection Magbeads veya AMPure XP boncukları.

[Notlar]

1. İki tür Evrensel Adaptör primer seti sunuyoruz (GDS Adaptörü, #KM002 ve #KM003, ayrıca satın alınır), ancak müşteriler ayrıca diğer üreticiler arasından seçim yapabilir veya MGI sıralama platformu için kendi Adaptörlerini sentezleyebilir.Çok fazla Bağdaştırıcı, Bağdaştırıcı dimerinin oluşmasına neden olur ve yetersiz Bağdaştırıcı, düşük kitaplık çıkışına yol açar.Bu nedenle, uygun Adaptör konsantrasyonu kitaplığın konsantrasyonunu ve kalitesini belirler.Farklı miktarlarda DNA girişi için önerilen adaptör konsantrasyonları aşağıdaki tabloda gösterilmektedir:

Tablo 2 Adaptörün Önerilen Kullanım Konsantrasyonları

* Adaptörün seyrelticiye hacim oranı olarak ifade edilir

2. 2× HIFI Library PCR Master Mix'te kullanılan enzim, 5 '-3' polimeraz ve 3 '-5' ekzonükleaz aktivitesine sahip, ancak 5 '-3' ekzonükleaz aktivitesine sahip olmayan bir B familyası DNA polimerazdır.Yüksek sadakat ve homojenliğe ve güçlü sürdürülebilir sentez yeteneğine sahiptir.Amplifikasyon döngülerinin sayısının sıkı kontrolü, kitaplık çıktısı için özellikle önemlidir.Aşağıdaki tablo, farklı DNA giriş miktarlarına karşılık gelen önerilen amplifikasyon döngüsü sayısını göstermektedir:

Tablo 3 Farklı Numune Girişlerine Karşılık Gelen Önerilen Amplifikasyon Döngüsü Sayısı

Not: 1. Yukarıdaki tablo, yalnızca referans amaçlı olan 150bp standart DNA kullanılarak yapılan test sonuçlarını göstermektedir.

2. Eksik konektörler kullanılıyorsa, eksiksiz bir kitaplık elde etmek için minimum döngü sayısı (1-3) yükseltilmelidir.

3. Giriş DNA'sının kalitesi düşükse veya boyut seçimi kitaplık yapımı sırasında yapılıyorsa, amplifikasyon döngülerinin sayısı uygun şekilde artırılmalıdır.

[Standart Kitaplık Oluşturma Süreci]

Parçalanma ve Son Onarım

1. Şablon DNA'nın çözücü bileşimini belirleyin, eğer EDTA yoksa doğrudan Adım 2'ye geçin;EDTA içeriyorsa, saflaştırma için 2,2× manyetik boncuk kullanılmalı veya Nötralizasyon için aşağıdaki tablodaki EDTA içeriğine göre karşılık gelen hacimde Nötralizasyon Tamponu eklenmelidir:

2. Aşağıdaki reaksiyonu 200 µl'lik bir PCR tüpünde hazırlayın:

3. Yukarıdaki sisteme 10 µl FEP Enzim Karışımı ekleyin, eşit şekilde üfleyin, kısaca santrifüjleyin veaşağıdaki reaksiyon için hemen PCR cihazına koyun:

Tablo 4 Farklı Boyutlarda Kitaplıklar Elde Etmek İçin Gerekli Tutma Süresi

Adaptör Ligasyon

1. Fragmantasyondan sonra mümkün olan en kısa sürede ligasyon reaksiyonuna devam edin ve hazırlığı sonlandırın.

2. Adaptörü Tablo 2'ye göre seyreltin.

3. Aşağıdaki reaksiyon sistemini hazırlayın:

4. Yavaşça vorteksleyin ve iyice karıştırmak için kısaca döndürün, kısaca santrifüjleyin ve tüm sıvıyı tüpün dibine toplayın.

5. Bir termal döngüleyicide aşağıdaki reaksiyonu gerçekleştirin:

Tavsiye edilenSiçin çözümPCR Temizleme/Beden Seçimi(belirli manyetik boncuk hacmi, gerçek numuneye göre ayarlanmalıdır.boyut)

1. Uygun bir santrifüj tüpüne 100 µl ligasyon ürünü hazırlayın.

2. Numuneye 100 µl yeniden süspanse edilmiş DNA seçim manyetik boncukları ekleyin.Bir pipetle 10 kez hafifçe üfleyin (veya 30 saniye vorteksleyin).Örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.

3. Boncukları süpernatandan ayırmak için tüpü uygun bir manyetik rafa yerleştirin.Çözelti berrak olduğunda, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve bir pipetle atın (boncukları atmayın).

4. Manyetik raftayken tüpe 200 µl %80 taze hazırlanmış etanol ekleyin.Oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin ve ardından süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın (boncukları rahatsız etmeyin).

5. Toplam iki yıkama için Adım 4'ü bir kez tekrarlayın.

Not: İkinci yıkamadan sonra tüm görünür sıvıyı çıkardığınızdan emin olun.

6. Tüp kapağı açıkken manyetik raftayken, manyetik boncukların yüzeyinde belirgin bir parlaklık kalmayana kadar boncukları havayla kurutun.

Not: Boncukları fazla kurutmayın, bu DNA'nın daha düşük geri kazanımına neden olabilir.Boncuklar çatlamaya başladığında çok kurudurlar.

7. Tüpü manyetik raftan çıkarın.Tüpe 22 ul elüsyon tamponu (10mM Tris-HCl, pH8.0-8.5) ekleyin.En az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak veya bir vorteks karıştırıcıda 30 saniye boyunca iyice karıştırın.Oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edin.

8. Tüpü manyetik rafa yerleştirin.5 dakika sonra (veya solüsyon berraklaştığında), 20 µl süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.Seçim tamamlanır ve seçilen DNA sonraki deneyler için kullanılabilir veya -20°C'de uzun süre saklanabilir.

Kütüphane Amplifikasyonu

1. Aşağıdaki reaksiyonu bir PCR tüpünde hazırlayın:

2. Yavaşça vorteksleyin ve iyice karıştırmak için kısaca döndürün, kısa bir süre santrifüjleyin ve tüm sıvıyı tüpün dibine toplayın.

3. Bir termal döngüleyicide aşağıdaki reaksiyonu gerçekleştirin:

Tavsiye edilenSiçin çözümPCR Temizleme/Beden Seçimi(belirli manyetik boncuk hacmi, gerçek numuneye göre ayarlanmalıdır.boyut)

1. Uygun bir santrifüj tüpüne 50 µl ligasyon ürünü hazırlayın.

2. Numuneye 45 µl yeniden süspanse edilmiş DNA seçim manyetik boncukları ekleyin.Bir pipetle 10 kez hafifçe üfleyin (veya 30 saniye vorteksleyin).Örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.

3. Boncukları süpernatandan ayırmak için tüpü uygun bir manyetik rafa yerleştirin.Çözelti berrak olduğunda, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve bir pipetle atın (boncukları atmayın).

4. Manyetik raftayken tüpe 200 µl %80 taze hazırlanmış etanol ekleyin.Oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin ve ardından süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın (boncukları rahatsız etmeyin).

5. Toplam iki yıkama için Adım 4'ü bir kez tekrarlayın.

Not: İkinci yıkamadan sonra tüm görünür sıvıyı çıkardığınızdan emin olun.

6. Tüp kapağı açıkken manyetik raftayken, manyetik boncukların yüzeyinde belirgin bir parlaklık kalmayana kadar boncukları havayla kurutun.

Not: Boncukları fazla kurutmayın, bu DNA'nın daha düşük geri kazanımına neden olabilir.Boncuklar çatlamaya başladığında çok kurudurlar.

7. Tüpü manyetik raftan çıkarın.Tüpe 22 ul elüsyon tamponu (10mM Tris-HCl, pH8.0-8.5) ekleyin.En az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak veya bir vorteks karıştırıcıda 30 saniye boyunca iyice karıştırın.Oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edin.

8. Tüpü manyetik rafa yerleştirin.5 dakika sonra (veya solüsyon berraklaştığında), 20 µl süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.Seçim tamamlanır ve seçilen DNA 2-8°C'de 1-2 hafta veya -20°C'de uzun süre saklanabilir.

[Ek]Çift Taraflı Seçim için Önerilen Şema

Çift turlu seçim gerekirse, beklenen kitaplık boyutuna göre uygun manyetik boncuk hacmini seçmek için aşağıdaki şemayı sağlıyoruz.Boyut seçimi, son onarımdan önce veya amplifikasyondan sonra yapılabilir.İki veya daha fazla çift turlu seçim, kitaplık verimini büyük ölçüde azaltacaktır.

Aşağıdaki tablodaki kitaplık hacmini 100 μl'ye kadar doldurun.Beklenen kitaplık boyutuna göre iki turda manyetik boncukların hacmini seçin.Ve seçim işlemini aşağıdaki talimatlara göre gerçekleştirin.

Tablo 5 Çift Yuvarlak Seçim için Tavsiye Edilen Manyetik Boncuk Miktarı

1. Kütüphane hacmini 200 µl'lik bir PCR tüpünde 100 µl'ye doldurun ve A olarak etiketleyin. A tüpüne Tablo 5'e (1. Tur) göre belirli bir hacimde Manyetik boncuk ekleyin. Bir pipetle 30 s hafifçe üfleyin.Örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.

2. Boncukları süpernatandan ayırmak için tüp A'yı uygun bir manyetik rafa yerleştirin.Çözelti berraklaştığında, süpernatantı yeni bir tüpe dikkatlice alın ve B olarak etiketleyin. Boncukları atın.

3. B tüpüne Tablo 5'e (2. Tur) göre belirli bir hacimde Manyetik boncuk ekleyin. 30 saniye boyunca bir pipetle hafifçe üfleyin.Örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.Tüp B'yi manyetik rafa yerleştirin.Çözelti berrak olduğunda, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.

4. Manyetik raftayken tüp B'ye 200 µl %80 taze hazırlanmış etanol ekleyin.Oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin ve ardından süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın (boncukları rahatsız etmeyin).

5. Toplam iki yıkama için Adım 6'yı bir kez tekrarlayın.

Not: İkinci yıkamadan sonra tüm görünür sıvıyı çıkardığınızdan emin olun.

6. B tüpü kapağı açıkken manyetik raftayken, manyetik boncukların yüzeyinde belirgin bir parlaklık kalmayana kadar boncukları havayla kurutun.

Not: Boncukları fazla kurutmayın, bu DNA'nın daha düşük geri kazanımına neden olabilir.Boncuklar çatlamaya başladığında çok kurudurlar.

7. Tüp B'yi manyetik raftan çıkarın.Tüpe 22 ul elüsyon tamponu ekleyin.En az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak veya bir vorteks karıştırıcıda 30 saniye boyunca iyice karıştırın.Oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edin.

Not: Hedeflenen yakalama gerçekleştirilmeyecekse elüsyon için elüsyon tamponu (10mM Tris-HCl, ph 8.0-8.5) ekleyin.Aksi takdirde elüsyon için sterilize edilmiş ultra saf su kullanılmalıdır.

• Tüp B'yi manyetik rafa yerleştirin.20 ul süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.

Yalnızca Araştırma Kullanımı İçin

GDSBio, yüksek kaliteli yaşam bilimi ürünlerinin araştırma ve geliştirmesine, üretimine ve satışına odaklanan yüksek teknoloji ürünü bir kuruluştur.Şirket, genel PCR, floresan kantitatif PCR, NGS depolama, nükleik asit elektroforezi ve diğer moleküler biyoloji teknolojilerine odaklanan çekirdek olarak PCR teknolojisi ile eksiksiz bir ürün yelpazesine sahiptir ve moleküler araştırma reaktifleri, moleküler in vitro diagnostik hammaddeler geliştirmiştir. nükleik asit ekstraksiyon ve tespit reaktifleri ve diğer ürünler.